丙型肝炎实验室技术研究进展

丙型肝炎实验室技术研究进展

病毒性肝炎，以其流行的全球性和对健康危害的严重性吸引着人们的广泛关注。以侵犯人类肝脏为靶器官的肝炎病毒，现在至少有7种，即甲型肝炎病毒(HAV)(属于小RNA病毒科)、乙型肝炎病毒(HBV)(属于噬肝DNA病毒科)、丙型肝炎病毒(HCV)(属于黄病毒科)、丁型肝炎病毒(HDV)(属于缺陷型病毒)、戊型肝炎病毒(HEV)(属于杯状病毒科)、已性肝炎病毒(HFV)(尚未确切)、庚型肝炎病毒(HGV)(属于黄病毒科)。

7种病毒的核酸类型、形态结构、抗原组成、致病性、免疫性和传播途径各不相同，此外，还有巨细胞病毒(CMV)、EB病毒等在经过肝脏时偶尔亦可引起肝炎。

第一节 从非甲非乙型肝炎到丙型肝炎

1968-1974年间，HAV、HBV感染特异性诊断方法相继建立，为临床诊断和筛选献血者提供了可靠的手段。但人们很快就发现除了HAV、HBV及CMV、EBV外，还有一种引起输血后肝炎的至病因子。1974年纽约血液中心的Pince及其同事对204例接受心血管手术的病人进行随访，6个月时有51人(25%)发生了输血后肝炎，其中有12人与HBV感染有关。

CMV显然不是输血后肝炎的原因，因为前者平均潜伏期太长，几乎与乙型肝炎相等。于是他们提出，对输血后肝炎的控制，需首先弄清另一种肝炎病毒。

1989年9月在东京召开的国际非甲非乙型肝炎会议上正式命名此种病毒为丙型肝炎病毒(HCV)，由HCV引起的肝炎称之为丙型肝炎(HC)。

第二节 HCV基因和功能

HCV是一种新的病毒类型，其基因组编码多肽与其他病毒序列之间整体同源性较小，然而几组实验结果表明，HCV是人类黄病毒(如黄热病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒)和动物瘟病毒(牛腹泻病毒和猪霍乱病毒)的远亲。

首先HCV 5，末端区域与瘟病毒的对应区域有较多的同源性(45%到49%)，而HCV多肽的亲水性同黄病毒多蛋白是很相符的，还有三者的基因结构和功能也是相似的。这与近来把它们分类为黄病毒中3个不同的属相一致。

HCV与瘟病毒、黄病毒的亲缘进化关系，可能促进将来有关HCV感染的生物学研究，亦可能有助于一些重要问题的解决，如：HCV非输血传播途径中可能涉及的媒介、某种细胞作为病毒储存库的可能性、是否存在病毒基因在宿主基因的整合导致慢性化、是否存在通常的嗜肝外的不同细胞的新嗜性引起临床表现的多样化、以及是否存有抗体依赖性加强现象等。此外，黄病毒减毒活疫苗的成功，为HCV重组疫苗的开发提供了乐观前景。

第三节 HCV株型和中国北方HCV株序列分析

自从1989年Choo报道HCV部分序列(7310bp)以来，许多研究者已完成了多个HCV全基因或基因片段分析。从已有的数据看，这些不同克隆的核苷酸(nt)有很大差异，同源性从57%到92%不等。不同型克隆间1.5)的血清进行了全基因序列分析。HCJ1为I型(美欧主要类型)，HCJ4为II型(日本主要类型)。

J6、J7分属于III型和IV型。分析结果：北京25例为II型，哈密8例II型，4例III型，4例II+III。因此，中国HCV基因型以II型为主，和日本的主要类型一致。虽然我所建立的三组克隆，可能同属一个株型，但这并不意味着中国只有1个株型存在。随着中国不同地区大量的HCV被克隆，可能还会发现其它株型，不过可以推论，HCVCHN1可能是中国的主要株型。

第四节HCV感染的实验诊断

目前用于HCV感染的实验诊断方法主要有两种，检测抗-HCV和HCV RNA。

一、抗-HCV检测

1989年5月，美国Chiron公司用分子克隆法分离到一个能表达NANB肝炎病毒特异性蛋白的cDNA克隆5-1-1。又将3个与5-1-1有共同ORF的重叠克隆连接起来建立了另一个克隆C100。C100与超氧化物歧化酶(SOD)基因融合在酵母中重组表达的多肽即C100-3。完整的C100-3多肽的N端有154个SOD氨基酸，5个由EcoRⅠ位点人工接头表达的氨基酸和363个HCV C100 cDNA编码的氨基酸；在其C端还有5个MS2的氨基酸。

HCV C100-3抗体检测系统，是最早应用的检测方法。世界各地关于HCV在各种人群中的感染率，基本上都是来自这种试剂盒的检测。检测结果证明，HCV是世界上几乎所有输血后非甲非乙型肝炎和部分散发性非甲非乙型肝炎的病因病毒。

由于C100只含363个氨基酸，而HCV基因组编码的蛋白有长达3010个氨基酸。因此C100-3抗原-抗体系统只代表整个HCV抗原抗体系统的一小部分，所以敏感性不高，抗C100-3出现也太晚，不适于早期诊断，有些病人根本不出现。而PCR方法却可检出HCV RNA，但有一定的漏检率。该方法使用的抗原含SOD融合蛋白，因此，当人体存有抗-SOD时常常出现假阳性。

随着HCV基因序列的阐明，人们发现C区基因编码蛋白较E区和某些非结构区蛋白都保守，因此，用C区基因产物检测HCV抗体显得更加合理，于是相继建立了一些新的检测方法，试图克服C100抗原的某些缺陷，称之为第二代抗-HCV试剂。

第二代重组基因多肽检测抗-HCV的ELISA技术是在原包被抗原 加入了核心抗原C22-3、C120、C11。和第一代试剂(C100-3)相比，第二代试剂具有检出率高(可提高25-30%)，而且抗体出现提早到16-60天。由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以仍存在抗-SOD造成的假阳性，问题于是激发人们建立人工合成肽段检测抗-HCV的新试剂。

我所用中国北方地区HCV全基因序列，根据文献开发的预测蛋白理化性质及二级结构和抗原决定簇可能位点的序列软件，完成了HCV全基因序列的亲水性、亲近性、移动性分析，已预测到HCV抗原决定簇的位点。先对研制的C区3个寡肽(CPA、CP36、CP20)进行了抗原活性比较并初步应用于临床，同时与日本基因工程C区表达多肽C11进行比较。

CP8+CP36阳性率与C11的阳性率无明显差异，符合率为87.6%。用本所建立的双PCR试验，比较82例抗-CP与HCV RNA的检测结果，符合率为87.5%。

二、HCV RNA的检测：

聚合酶链反应是目前分子生物学中最敏感的方法，样品中只要有一个拷贝的HCV序列就有可能被检出。由于HCV在被感染者体内浓度很低，不能用一般的免疫学技术检测病人血清中的抗原，目前只能用逆转录DNA PCR(RT-PCR)才能检测到血清中的HCV RNA。PCR技术有许多优点：

1、特异性强 抗-HCV阳性不能直接说明受检者体内当时HCV是否存在，而PCR所检的HCV RNA可作为有无传染性的直接指标。

2、敏感性高 可发现抗-HCV阴性者HCV感染。

3、阳性出现早 可在ALT增高的同时检出。黑猩猩感染HCV后第三天即可在血清中检出HCV RNA。

4、应用较广泛 可检测组织和体液中RNA。但操作程序较复杂，技术要求严格，试验成本高，所以只限于有条件的实验室使用。1991年我所建立了一项直接检测HCV PCR的双重PCR法，亦可称“一步法”。特点是微量(可从100μL血清中提到RNA)、简便(不用低温超速离心机等设备)、快速(从提取RNA逆转录可在4小时完成)、减少Rnase污染，1-2天内可发报告。由于PCR的诸多优点，只要不断的改进方法，使之更趋简便、快速，必将成为HCV感染诊断的重要手段。

我所最近的研究结果表明，在原RT-PCT的基础上再进行定量PCR，其方法是在样品PCR反应混合液内加入3HdTTP掺入，液闪法测定3H掺入的CPM值以纯化已知浓度的cDNAsfuw(10pg/每管30Ul)，再计算待测血清中RNA的动态变化。初步研究结果发现，在治疗前后血清中RNA的深度变化较大。2例病人用α-干扰素治疗的病人中，虽然血清ALT转为正常，但血清中的RNA含量变化不大。提示该方法对丙型肝炎的疗效观察有一定的参考价值。

现在市售的抗-HCV试剂盒，分别由重组基因多肽人工合成多肽组成，基因工程多肽的优点是：1、可包含多个抗原位点。2、一旦克隆表达成功则产量高、价格低。3、表达多肽的稳定性好。

缺点是：1、克隆表达技术要求较高，不易达到满意结果。2、表达产物纯化困难，含有菌体等其它蛋白干扰。3、每批产量间稳定性比间差异小。3、可将几个片段重合使用，有较高的特异性和敏感性。4、纯化简单，无其它蛋白干扰。5、可做抑制试验。我们合成的EP27及其检测结果，提示了它与第二代抗-HCV试剂的不同点。不过这项研究刚刚开始，所得结果仅是初步的。对E区试剂的开发只是一个尝试或者说刚刚敲开了E区基因的大门，研究尚待深入。